❀以human TMEM187基因为例进行oligo实操设计

（1）您可以通过以下在线工具设计：

麻省理工学院的CRISPR Design：http://crispr.mit.edu/

（2）选取

ccggttccagATGAATCCAGAGTGGGGGCAGGCCTTCGTGCACGTGGCCGTGGCCGGTGGCCTCTGTGCCGTGG
  CTGTGTTCACGGGCATTTTCGACAGTGTTTCCGTGCAAGTGGGCTATGAGCACTAC

（3）输入序列信息（以human TMEM187基因为例）：一次只能输入23-250bp之间大小的基因片段，好一次只输入一个外显子。

出现下图界面：

（4）点提交，出现以下界面（约需几分钟）：

（5）点Download as genbank；

（6） 点击Download as genbank后出现以下界面：根据左边不同Guide序列score的高低选取合适的Guide序列，score的高低并不代表敲除效率的高低，所以为提高敲除的成功率，一般选择2-3个Guide序列，构建2-3个敲除载体。

❀文献资料

1. Jinek, M., Chylinski, K., Fonfara, I., Hauer, M., Doudna, J.A., and Charpentie E. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptiv bacterial immunity. Science, 2012,337: 816～821. 
2. Horvath P., Barrangou R. CRISPR/Cas, the immune system of bacteria and archaea. Science, 2010, 327 (5962): 167～170. 
3. Hale CR, Zhao P., Olson S., et al. RNA-Guided RNA Cleavage by a CRISPR RNA-Cas Protein Complex. Cell, 2009, 139 (5): 945～956.
4. Zhang F., et al. Multiplex Genome Engineering Using CRISPR/Cas Systems. Science , 2013, 339(6121): 819～823 
5. Westra ER., Swarts DC., Staals RH., Jore MM., Brouns SJ., van der Oost J. The CRISPRs, they are a-changin': how prokaryotes generate adaptive immunity. Annu Rev Genet, 2012, 46: 311～339. 
6. Marraffini LA., Sontheimer EJ. CRISPR interference: RNA-directed adaptive immunity in bacteria and archaea. Nature Rev Genet, 2010, 11 (3): 181～190. 
7. Jiang, W., Bikard, D., Cox, D., Zhang, F., and Marraffini, L.A. RNA-guided editing of bacterial genomes using CRISPR-Cas systems. Nature Biotechnology, 2013, 31: 233～239.
8. Hwang WY., Fu Y., Reyon D., Maeder ML., Tsai SQ., Sander JD., Peterson RT., Yeh JR., Joung JK. Efficient genome editing in zebrafish using a CRISPR-Cas system. Nature Biotechnology, 2013, 31:227～229 
9. Liu P, Long L, Xiong K, Yu B, Chang N, Xiong JW, Zhu Z, Liu D. Heritable/conditional genome editing in C. elegans using a CRISPR/Cas9 feeding system. Cell Research. 2014, 24(7):886～889. 
10. Barrangou R. RNA events. Cas9 targeting and the CRISPR revolution. Science. 2014, 344(6185):707～708. 11. Nishimasu H., et al. Crystal structure of Cas9 in complex with guide RNA and target DNA. Cell, 2014, 156(5)935～949

GP0126-pGK-Blank质粒说明书.pdf

GP0132-pGK1.1质粒说明书.pdf

GP0139-pGK1.2质粒说明书.pdf

GP0131-pGK1.0质粒说明书.pdf

GP0127-pGK2.0质粒说明书.pdf

GP0128-pGK2.1 质粒说明书.pdf

GP0140-pGK2.2质粒说明书.pdf

Q&A

Q-1：pGK系列敲除质粒的几款产品之间的区别在哪呢？

A-1:Cat. No. :GP0131~GP0140 都是应用于哺乳动物细胞敲除系统的， GP0132和GP0128带有 Puro 抗性，GP0131带有 Neo 抗性，GP0139和GP0140带有 EGFP+Puro 抗性。添加这些抗性可以对转化效率比较低的细胞进行初筛，以提高阳性克隆筛选的效率。

Q-2:靶位点设计有哪些注意事项？

A-2：目前有几个在线设计软件，我们推荐使用Zhang Feng lab：http://crispr.mit.edu/，该软件会对每一个潜在的靶位点打分，并告知是否存在脱靶现象。在设计oligo序列时，需要特别注意由于H1 promoter的转录起始位点为A，如果你选取的Guide序列的第一个碱基不是A，应在设计上游引物时加上一个T。由于U6 promoter的转录起始位点为G，如果你选取的Guide序列的第一个碱基不是G，应自行加一个G上去。另外score的高低并不代表敲除效率的高低，所以为提高敲除的成功率，一般选择3~5个Guide序列，先构建3~5个单敲除载体。后续先在pool细胞的基础上验证出有效的位点，再拿有效的两个位点构建双敲载体，做正式电转，筛选单克隆。

Q-3：转染效率低，怎么办？

A-3：因为Cas9蛋白比较大，就导致整个敲除质粒较大（10kb左右），如此大的质粒很容易导致转化效率低下，尤其是使用脂质体等化学试剂转染时，转染效率会比较低些。所以，我们推荐使用电转的方法进行转染。Bio-Rad的电转仪器需要根据不同的细胞单独配制转染buffer，所以不推荐使用；Life的Neon系统不错，但是因为耗材是镀金的，所以非常贵；而Genloci的细胞电转仪，转染效率高，一次成本投入，后续转染耗材便宜，操作也方便，尤其适用于难转染的细胞系。

Q-4：单个细胞不生长，怎么办？
A-4：对于单细胞不长的细胞进行敲除，首先建议采用共培养的方法看看能否促进单个细胞的生长。共培养可以采用培养过同种细胞的培养基培养单细胞；也可以使用Cell Plaza®单细胞培养板，可以把细胞的存活率提高三倍以上。如果以上方法都不行，建议对细胞进行改造，加快其分裂速度，让单细胞可以很容易生长后，再对目的基因进行敲除。具体方法可以联系Genloci的客服做进一步的了解。

Q-5：在做高通量样本时，如何才能快速筛选得到阳性克隆？
A-5：建议使用错配酶进行筛选，可加快筛选的流程。目前市面上主要有三种错配酶：Cruiser®基因敲除检测错配酶、T7E I和Surveyor酶。其中，Cruiser®基因敲除检测错配酶和Surveyor酶属于Cel I家族，这两种酶的筛选特异性比T7E I高。在酶切筛选过程中，T7E1的特异性较差，容易出现假阳性的结果，这在一定程度上阻碍了阳性克隆的筛选进度；Surveyor酶较贵，并且货期较长，所以我们推荐Cruiser®基因敲除检测错配酶，它特异性高且价格合理。