阳性对照DNA  为杂交后的DNA片段，经Cruiser^®基因敲除检测错配酶切割后形成三个明显片段，分别为393 bp、134 bp、259 bp，其中134  bp和259 bp片段是酶切后片段，而393 bp片段为杂交形成的homo-duplex  DNA片段，无酶切割位点，因此片段大小不变（Figure1.）。

Figure 1.  阳性对照和Pool检测的电泳结果       Figure 2. K562细胞中Atg10基因敲除案例

上图中，M：100 bp-DNA  Marker；   Positive：阳性对照DNA；   Pool：混合克隆；   Clone1-7：单克隆。  

A.  混合样本分析：  

根据酶切后条带的亮度大致估测敲除效率，并送测序验证。因不同宿主物种中敲除载体的转染效率的差异，Pool验证阳性的可能性也会有较大差异，甚至存在Pool验证显示阴性，但最终却筛选到阳性克隆的情况，一般地，被转染的细胞比例越高，Pool检测越容易进行（见Figure1.）。  

B.  单克隆结果分析

如上图Figure2.所示为杂交后直接酶切的结果：clone3,5和6为潜在的阳性克隆，后续直接进行TA克隆和测序验证等位基因突变情况。  

进一步对上述阴性单克隆间进行两两杂交反应（例如clone1与2杂交，clone4与7杂交……），再进行酶切，步骤如前述，然后再次电泳检测，结果分析如下：  

①若电泳结果显示阴性，则可判定Clone A与Clone  B均为野生型，即未敲除（当然不排除Clone A与Clone B均为纯合突变型且突变后序列完全一致，但几率较小，几乎为零，所以不考虑）。

②若电泳结果显示阳性（经验证明，这种情况几率也不是很大，此步骤能帮助筛选出两个亲本完全相同的敲除），则说明Clone  A与Clone B中至少有一个为两个亲本相同KO情况的纯合突变型，此时可将Clone A、Clone  B分别与野生型杂交，再进行一轮酶切验证即可，阳性克隆送测序验证突变情况。

GP0102,GP0103-Cruiser基因敲除检测试剂盒说明书.pdf

Q&A

Q-1：PCR 反应后，电泳检测条带不亮，或者有杂带怎么办？

A-1：建议在正式实验前先摸索好引物的PCR条件。

①若条带不亮，则更换引物，若是因为基因本身的序列问题（如GC含量高），无法找到合适的引物， 则取第一轮PCR产物1μL，以30μL体系扩增第二轮（见下图Figure 4.），再用二轮产物进行后续的酶切实 验。或者适当增加PCR循环数，比如40 cycles。

②若有杂带，则更换引物，若是因为基因本身的序列问题（如特异性较低），无法找到合适的引物，此 时若杂带的大小与Cruiser^®基因敲除检测错配酶酶切后产生的片段大小不同，则可以直接酶切（见下图Figure 5中红箭头处的条带大小则为杂带，而它与下端的酶切条带大小不一致，不影响判断）。

③若没有条带，则需要确认细胞是否为该物种名称的细胞，若用其它该物种的引物可以PCR出正确大 小的条带，则可以排除细胞错误的可能，需重新设计PCR用引物，或者尝试使用其它公司的高保真酶。

Figure 4.扩增获得目的片段一轮PCR（上）和二轮PCR（下）电泳图

Figure 5. PCR扩增目的片段有杂带，但不影响酶切的酶切电泳图

Q-2：酶切后，电泳结果仅有原片段而无酶切条带？
A-2：请先确定 Marker 是否明亮，阳性对照是否正常（阳性对照正常电泳图详见结果分析），未酶切前原PCR 片段是否明亮？若是因为以上原因造成酶切结果异常（无酶切条带、酶切条带较弱），请先按下图予以纠正。

在 Marker 明亮，阳性对照明亮且已被切开，样品原条带明亮的情况下，样品没有酶切条带，则造成该 实验结果有以下几种可能：
a.样品均为阴性，即 DNA 片段中无突变位点，可重新进行上游实验，也可通过对该 DNA 片段 进行测序验证；
b.PCR 产物没有进行杂交，请检查反应底物是否经过杂交 DNA 步骤。
c.所使用 PCR 用酶体系与Cruiser^®基因敲除检测错配酶反应体系冲突，建议选购Cruiser^®基因敲除检测试剂盒。
d.DNA 片段中杂交 DNA 含量过低，致使反应后条带不易观察到。此情况应优先考虑改善杂交 条件，杂交时以更缓慢的变速降温至 40℃以下，有条件的可使用金属浴或水浴退火。

Q-3：酶切后，电泳结果中原片段明亮但酶切条带较弱？
A-3：在 Marker 明亮，阳性对照明亮且已被切开，样品原条带明亮的情况下，样品酶切条带较弱，则可能是因为样品 DNA 片段中杂交 DNA 含量过低。该情况也常见于 cell pool 检测中，因 cell pool 中阳性克隆（靶基因突变细胞）比例过低，导致获得 DNA 片段中杂交 DNA 含量 过少。此时建议加大底物量（10μL 的酶切体系所加的底物量最多不超过 7μL，所用Cruiser^®基因敲除检测错配酶 1μL 量不变） 对于单克隆筛选中出现此中情况，应优先考虑改善杂交条件，杂交时以更缓慢的变速降温至 40℃以下，有 条件的可使用金属浴或水浴退火。
  
Q-4.酶切后，电泳结果酶切条带轻微弥散？
A-4：该现象可能原因如下：
当酶切后条带<200 bp，且经较长时间的核酸电泳，条带宽度变大，亮度不足时呈现类似弥散的带型； 当突变位点过长，尤其当突变长度达到 50 bp 以上时，酶切后条带易出现弥散现象，此时弥散程度会因酶 切后条带大小的不同而不同，片段越小弥散情况越明显。
原因可能如下：
 a.酶切后条带较小，在电泳时导致条带宽度变大造成弥散，使用更高浓度的琼脂糖凝胶，如 2%等；
 b.琼脂糖凝胶放置过久，推荐使用新配置的胶；
 c.样品有核酸酶污染；
 d.反应体系中 Mg2+的含量不足时，此时可以每 10μL加入 3μL Cruiser® 缓冲溶液(5x)；
 e.酶切反应结束要先等 PCR 仪温度降到 4℃后立即拿出加 2μL 终止缓冲溶液(6x)，随后立刻进行琼脂糖凝
胶电泳检测或置于-20℃保存。

Q-5：酶切后，电泳结果中酶切条带大小不是预期大小？
A-5：出现该情况表明制备的 DNA 片段中含有其他杂交位点，可能性如下：
①制备的 DNA 片段存在其他 DNA 的污染，或者 KO 后缺失或者插入比较多长度，对于缺失或者插入 比较多的情况，单纯的 PCR 结束电泳检测即可肉眼分别出阳性，Cruiser^®基因敲除检测错配酶酶切可再次验证阳性；
②根据酶切结果：若酶切后形成的各条带单一，则在 DNA 片段上可能含有其他杂交位点，需通过进一 步 DNA 测序检测；若形成的酶切条带数量远多于预期，且随机分布含一定弥散，则可能是 DNA 片段扩增 中，DNA 聚合酶错配扩增导致，更换高保真 DNA 聚合酶重新进行扩增可消除影响；
③如果 PCR 反应出现非特异性扩增的条带，也会导致同样情况，解决方案见 FAQ 中的 Q-1 中有杂带 的情况。

Q-6：酶切后，如何使电泳图酶切条带更亮？
A-6：为了改善酶切效果，使酶切出的条带更亮一点，通常采取以下措施：
①优先考虑改善杂交条件：杂交时以更缓慢的变速降温至 40℃以下，有条件的可使用金属或水浴退火；
②适当增加酶切底物量，如 2μL 增加至 5μL，最多不超过 7μL（以 10μL 酶切体系不变）
④增加样品 DNA 浓度：PCR 反应再扩增一轮。

Q-7：Cruiser^®基因敲除检测错配酶 检测结果是否会出现假阳性？
A-7：Cruiser^®基因敲除检测错配酶是通过基因工程生产的 Cel I 同源核酸内切酶，具有更好的稳定性、高度的特异性 和高效性，它能够切割所有形式的碱基突变形成的异源 DNA 双链。目前为止，尚未有文献报道使用Cruiser^®基因敲除检测错配酶 或 Cel I 会出现假阳性。

Q-8.酶切后，电泳结果中酶切条带大小与预期一致，就一定是纯合子吗？
A-8：因为杂交的 DNA 片段是通过 PCR 得到的，所以特异性没有任何问题。在得到与预期一致的酶切条带 后，不能 100%判断该样本为纯合子，因为杂合子也能得出同样的结果。因此，需要对 PCR 片段进行的 TA克隆和测序分析。